過表(biao)達穩轉(zhuan)細(xi)胞系(xi)構建

基(ji)因(yin)過表(biao)達細(xi)胞株(zhu)構(gou)建服(fu)務(wu)包括(kuo)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)過表(biao)達慢(man)病毒(du)載(zai)體(ti)構建、病(bing)毒(du)包裝(zhuang)、細(xi)胞轉(zhuan)染和(he)篩(shai)選。您只(zhi)需(xu)提供(gong)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的cDNA質粒或目(mu)的(de)序(xu)列信息和需(xu)要構建的(de)細(xi)胞系(xi)，我們(men)將按(an)照您的(de)要求完(wan)成(cheng)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)過表(biao)達細(xi)胞株(zhu)的(de)構建和(he)檢(jian)測，提供(gong)給您高(gao)質量(liang)的基(ji)因(yin)過表(biao)達穩定(ding)細(xi)胞株(zhu)。

服(fu)務特點(dian)

1、多種(zhong)不同啟(qi)動(dong)子(zi)和(he)標簽(qian)的(de)慢(man)病毒(du)表(biao)達載(zai)體(ti)可供(gong)選擇。

2、采用(yong)慢(man)病毒(du)系(xi)統(tong)構建，基(ji)因(yin)整(zheng)合穩定(ding)。

3、根(gen)據(ju)您的(de)需(xu)要可以提供(gong)經(jing)濟(ji)實(shi)惠的多(duo)克隆細(xi)胞系(xi)或者(zhe)高(gao)品(pin)質的單克隆細(xi)胞系(xi)。

您需(xu)提供(gong)的資(zi)料

1.客(ke)戶提供(gong)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的序(xu)列，如果提供(gong)模(mo)板(ban)，請告(gao)知載(zai)體(ti)、酶切穩點(dian)等(deng)信息；

2.若實驗(yan)材(cai)料為(wei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞或(huo)者(zhe)特(te)殊培養的細(xi)胞，請(qing)先(xian)咨詢(xun)；

3.公(gong)司(si)默(mo)認提供(gong)病毒(du)滴(di)度為(wei)1x107-1x108TU/ml,規格(ge)1ml；

4.目(mu)的(de)蛋白的(de)功(gong)能(neng)驗證另外(wai)收(shou)費(fei)。

我們(men)提交的內容(rong)

1、實(shi)驗報告(gao)內容(rong)：

A 慢(man)病毒(du)載(zai)體(ti)構建報告(gao)及測(ce)序(xu)結果(guo)。

B 細(xi)胞篩(shai)選(xuan)實驗報告(gao)。

C 目(mu)的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達檢(jian)測(ce)結(jie)果。

2、產(chan)品(pin)內容(rong)：

A 已(yi)構建慢(man)病毒(du)載(zai)體(ti)；

B 多克隆細(xi)胞系(xi)構建服(fu)務(wu)提供(gong)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)過表(biao)達細(xi)胞株(zhu)及(ji)EGFP表(biao)達對照細(xi)胞株(zhu)各(ge)壹株(zhu)，單(dan)克隆細(xi)胞株(zhu)構(gou)建服(fu)務(wu)提供(gong)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)過表(biao)達單(dan)克隆細(xi)胞株(zhu)2-3株(zhu)及EGFP過表(biao)達對照細(xi)胞株(zhu)壹株(zhu)。

原(yuan)代(dai)細(xi)胞培養

將動物各種(zhong)組織從(cong)機(ji)體(ti)中(zhong)取出(chu)，經(jing)各(ge)種(zhong)酶(常用胰(yi)蛋白酶(mei))、螯合劑(常用EDTA) 或(huo)機(ji)械方法處(chu)理(li)，分散成(cheng)單(dan)細(xi)胞，在合適的(de)培養基(ji)中(zhong)培養，使(shi)細(xi)胞得(de)以生存(cun)、生長(chang)和繁(fan)殖(zhi)，麟美生物提原(yuan)代(dai)培養服務供(gong)給您高(gao)質量(liang)的原(yuan)代(dai)細(xi)胞株(zhu)。

服(fu)務特點(dian)

1、原代(dai)細(xi)胞分(fen)離(li)培養與鑒定(鑒定可提供(gong)流式細(xi)胞儀檢測(ce)、免(mian)疫細(xi)胞化(hua)學、RT-PCR 、蛋白免(mian)疫(yi)印跡等(deng)多種(zhong)方法檢(jian)測)。

2、細(xi)胞傳(chuan)代(dai)代(dai)數低(壹般(ban)4代(dai))，細(xi)胞狀(zhuang)態(tai)好，無汙染。

3、根(gen)據(ju)您的(de)需(xu)要可以提供(gong)多種(zhong)原代(dai)培養的細(xi)胞。

您需(xu)提供(gong)的資(zi)料

1、詳(xiang)細(xi)說(shuo)明進(jin)行(xing)原代(dai)細(xi)胞培養的組織，並確(que)定組織(zhi)是由(you)客(ke)戶提供(gong)還是本(ben)公(gong)司(si)提供(gong)。

2、盡(jin)可能(neng)提供(gong)該原(yuan)代(dai)細(xi)胞的(de)培養條(tiao)件(jian)，或者(zhe)由(you)本(ben)公司(si)摸(mo)索(suo)培養條(tiao)件(jian)。

3、對於(yu)壹些(xie)常見(jian)的原(yuan)代(dai)培養組織，因(yin)為保存運(yun)輸的不便(bian)可能(neng)會降(jiang)低原(yuan)代(dai)培養的成(cheng)功(gong)率(lv)，建議客戶選擇由本(ben)公司(si)提供(gong)相應的(de)組(zu)織。

我們提交的內容(rong)

提供(gong)凍存或處(chu)於(yu)對數生長(chang)期的(de)細(xi)胞株(zhu)壹瓶(細(xi)胞培養條(tiao)件(jian)，圖(tu)片(pian))。

幹(gan)細(xi)胞培養服務

提供(gong)廣泛(fan)的(de)幹細(xi)胞產(chan)品(pin)，覆(fu)蓋(gai)胚(pei)胎(tai)和(he)誘導多能(neng)幹細(xi)胞，神(shen)經(jing)幹(gan)細(xi)胞，間(jian)充(chong)質幹細(xi)胞（MSC），造(zao)血(xue)幹細(xi)胞和(he)癌(ai)癥幹細(xi)胞等(deng)幹細(xi)胞培養服務。

服務特點

1、幹(gan)細(xi)胞分(fen)離(li)培養與鑒定(鑒定可提供(gong)流式細(xi)胞儀檢測(ce)、免(mian)疫細(xi)胞化(hua)學、RT-PCR 、蛋白免(mian)疫(yi)印跡等(deng)多種(zhong)方法檢(jian)測)。

2、細(xi)胞傳(chuan)代(dai)代(dai)數低(壹般(ban)4代(dai))，細(xi)胞狀(zhuang)態(tai)好，無汙染。

3、根(gen)據(ju)您的(de)需(xu)要可以提供(gong)多種(zhong)原代(dai)培養的細(xi)胞。

細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)

壹、流式熒(ying)光(guang)染色(se)法(fa)

原理(li)：

熒(ying)光(guang)染料CFSE， 即(ji)羥(qiang)基(ji)熒(ying)光(guang)素二醋酸(suan)鹽琥珀酰(xian)亞胺脂(zhi)，是壹種(zhong)可穿透(tou)細(xi)胞膜(mo)的(de)熒(ying)光(guang)染料，具有與細(xi)胞特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合的琥珀酰(xian)亞胺脂(zhi)基(ji)團和(he)具有非酶(mei)促水解作(zuo)用的(de)羥(qiang)基(ji)熒(ying)光(guang)素二醋酸(suan)鹽基(ji)團，這(zhe)使(shi)得(de)CFSE成(cheng)為(wei)壹種(zhong)良好的細(xi)胞標記(ji)物。當細(xi)胞進(jin)行(xing)分裂增殖(zhi)時(shi)，具有熒(ying)光(guang)的(de)胞質蛋白被(bei)平均(jun)分(fen)配(pei)到(dao)**代(dai)細(xi)胞中(zhong)，這(zhe)樣與(yu)**代(dai)細(xi)胞相(xiang)比(bi)，其熒(ying)光(guang)強度(du)便(bian)會減(jian)弱至(zhi)壹半(ban)；以此(ci)類推，分裂得到(dao)的第三代(dai)細(xi)胞的(de)熒(ying)光(guang)強度(du)便(bian)會比(bi)**代(dai)細(xi)胞再次減(jian)弱。這(zhe)種(zhong)現象(xiang)可(ke)以在488nm的激發(fa)光(guang)下，采用流式細(xi)胞儀檢測(ce)分(fen)析(xi)，通(tong)過檢測到(dao)細(xi)胞熒(ying)光(guang)強度(du)不斷(duan)的降(jiang)低，進(jin)壹步分析(xi)得出(chu)細(xi)胞分(fen)裂(lie)增殖的(de)情(qing)況。

實(shi)驗步驟，以小鼠(shu)脾細(xi)胞為(wei)例(li)：

1.取壹只(zhi)6-8周(zhou)小鼠(shu)頸椎脫臼處死(si)後，將其(qi)全(quan)部浸泡(pao)於(yu)75%酒精中(zhong)；

2.在超凈(jing)工作(zuo)臺上(shang)無菌取出(chu)小鼠(shu)脾臟；

3.用(yong)無菌註射(she)器內芯(xin)研(yan)磨脾臟，盡(jin)量(liang)不殘(can)留較(jiao)大組(zu)織塊；再用3mlPBS沖洗後，將脾臟研(yan)磨液經(jing)200目(mu)尼(ni)龍(long)網(wang)過濾(lv)至(zhi)15mL離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，離(li)心(xin)350g，5min；

4.棄上(shang)清後(hou)，加(jia)入2mL紅(hong)細(xi)胞裂(lie)解液(ye)，輕微(wei)吹打(da)，裂(lie)解2min後(hou)加(jia)入等(deng)體(ti)積PBS終(zhong)止裂解反(fan)應，混(hun)勻(yun)後(hou)離(li)心(xin)350g，5min；

5.棄上(shang)清，用(yong)RPMI1640完(wan)全(quan)培養基(ji)重懸(xuan)沈澱，並(bing)取10μL細(xi)胞液(ye)計數，將細(xi)胞濃度調(tiao)至(zhi)2.0×106/ml；

6.提前(qian)將(jiang)CFSE按(an)照說(shuo)明書(shu)用(yong)DMSO配成(cheng)5mM母(mu)液，並(bing)分裝(zhuang)儲存(cun)於(yu)-80冰箱(xiang)，其工作(zuo)濃度為(wei)0.5-25μM；

7、取部分(fen)細(xi)胞作(zuo)為(wei)不染色(se)組(zu)陰(yin)性(xing)對照，其他細(xi)胞加(jia)入CFSE溶(rong)液(ye)，使(shi)得(de)終(zhong)濃度為(wei)5μM，37°C避(bi)光孵(fu)育15min；

8、加(jia)入1ml冰(bing)冷(leng)的RPMI1640完(wan)全培養液，4℃，5min以中(zhong)止染色(se)；

9、棄上(shang)清，加(jia)入冰(bing)冷(leng)的含10%FBS的完(wan)全1640培養液洗2次，*後(hou)用(yong)1640完全(quan)培養基(ji)重懸(xuan)細(xi)胞沈澱，充(chong)分吹(chui)打(da)成(cheng)單(dan)細(xi)胞懸(xuan)液，將(jiang)上(shang)述(shu)細(xi)胞懸(xuan)液加(jia)入96孔(kong)培養板(ban),每孔(kong)105個(ge)細(xi)胞（陽(yang)性(xing)對照用PHA刺激(ji)）；

10、37℃，5%CO2培養3天後用流式細(xi)胞儀分析(xi)細(xi)胞488nm激(ji)光(guang)器檢查細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)情(qing)況。

結(jie)果分析(xi)：用FlowJo分析(xi)細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)

在FSC/SSC 上(shang)圈出(chu)目(mu)標細(xi)胞，使(shi)用(yong) FSC-W/FSC-A 排(pai)除黏連體(ti)，使(shi)用(yong) CFSE 單(dan)參(can)看(kan)目(mu)標細(xi)胞的(de)增(zeng)殖情(qing)況。以下圖(tu)片(pian)來(lai)源於(yu)網絡(luo)：細(xi)胞攝(she)取染料後(hou)，信(xin)號(hao)強，在右邊（不分(fen)裂的(de)話(hua)，就是那(na)個(ge)桃(tao)紅色(se)的峰(feng)），隨著(zhe)細(xi)胞的(de)每壹次分(fen)裂(lie)，細(xi)胞內染料的(de)濃度被(bei)稀(xi)釋(shi)壹倍，信(xin)號(hao)也(ye)減弱壹半(ban)，以此(ci)類推，由於(yu)細(xi)胞的(de)分(fen)裂不同步，所以*後的(de)結果(guo)是紅(hong)色(se)的那(na)些(xie)齒狀(zhuang)的(de)峰(feng)。

實驗(yan)要點：

CFSE的(de)濃度國(guo)外(wai)報道(dao)從(cong)0.5uM-20uM都有，建議終濃度為(wei)2.5-5uM。濃度太低，細(xi)胞標記(ji)的熒(ying)光(guang)強度(du)不夠(gou)，太高(gao)了對細(xi)胞有毒(du)性(xing)，且(qie)影響(xiang)細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)。標記(ji)孵(fu)育時(shi)要經(jing)常搖勻(yun)。

二(er)、CCK-8法

實驗原(yuan)理(li)：

CellCounting Kit-8（簡稱CCK-8）中(zhong)含有WST-8【化學名(ming)：2-(2-甲(jia)氧(yang)基(ji)-4-硝(xiao)基(ji)苯基(ji))-3-(4-硝(xiao)基(ji)苯基(ji))-5-(2,4-二磺(huang)酸(suan)苯)-2H-四唑單鈉(na)鹽】，它在電子載體(ti)1-甲氧(yang)基(ji)-5-甲基(ji)吩嗪(qin)鎓硫酸(suan)二甲(jia)酯（1-Methoxy PMS）的(de)作用下被細(xi)胞中(zhong)的(de)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)還原為具有高(gao)度水溶性(xing)的(de)黃色甲瓚(zan)產(chan)物（Formazan dye），生成(cheng)的(de)甲(jia)瓚(zan)物的數量(liang)與活(huo)細(xi)胞的(de)數量(liang)成(cheng)正比。因(yin)此(ci)可利(li)用這(zhe)壹特(te)性(xing)直接(jie)進(jin)行(xing)藥物篩選(xuan)、細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)測定、細(xi)胞毒(du)性(xing)測(ce)定、腫瘤(liu)藥敏試(shi)驗等(deng)。

細(xi)胞周(zhou)期

細(xi)胞周(zhou)期指細(xi)胞壹個(ge)世(shi)代(dai)所經(jing)歷(li)的時(shi)間。從(cong)壹次細(xi)胞分(fen)裂(lie)結束到下壹次分(fen)裂(lie)結束為壹個(ge)周(zhou)期。細(xi)胞周(zhou)期反(fan)應了細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)速(su)度。單(dan)個細(xi)胞的(de)周(zhou)期測(ce)定可采(cai)用(yong)縮(suo)時(shi)攝影(ying)的方法，但(dan)它不能(neng)代(dai)表(biao)細(xi)胞群(qun)體(ti)的周(zhou)期，故(gu)現多(duo)采(cai)用其(qi)他方法測(ce)群體(ti)周期。測(ce)定細(xi)胞周(zhou)期的(de)方法很多，有同位素標記(ji)法、細(xi)胞計數法等(deng)。

壹、BrdU法(fa)

1、原(yuan)理(li)

BrdU（5-溴脫氧尿(niao)嘧(mi)啶核苷(gan)）加(jia)入培養基(ji)後，可(ke)做(zuo)為(wei)細(xi)胞DNA復(fu)制(zhi)的原(yuan)料，經(jing)過兩(liang)個(ge)細(xi)胞周(zhou)期後(hou)，細(xi)胞中(zhong)兩(liang)條(tiao)單鏈(lian)均(jun)含BrdU的DNA將(jiang)占l/2，反(fan)映(ying)在染色(se)體(ti)上(shang)應表(biao)現為(wei)壹條(tiao)單體(ti)淺(qian)染。如經(jing)歷(li)了三(san)個周(zhou)期，則染色(se)體(ti)中(zhong)約壹半(ban)為(wei)兩(liang)條(tiao)單體(ti)均(jun)淺(qian)染，另壹半(ban)為(wei)壹深(shen)壹淺(qian)。細(xi)胞如果僅(jin)經(jing)歷(li)了壹個(ge)周(zhou)期，則兩(liang)條(tiao)單體(ti)均(jun)深(shen)染。計分裂(lie)相中(zhong)各(ge)期比(bi)例，就可算出(chu)細(xi)胞周(zhou)期的(de)值(zhi)。

細(xi)胞周(zhou)期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小(xiao)時(shi)）

2、儀器、用(yong)品(pin)與試(shi)劑

2.1、儀器、用(yong)品(pin)：同常規細(xi)胞培養

2.2、試(shi)劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸(suan)，Giemsa染液(ye)，秋水仙(xian)素，2×SSC液

3、操(cao)作步驟

3.1、細(xi)胞生長(chang)至指數期時(shi)，向(xiang)培養液中(zhong)加(jia)入BrdU，使(shi)*終(zhong)濃度為(wei)10μg/ml。

3.2、44小(xiao)時(shi)加(jia)秋水仙(xian)素，使(shi)每ml中(zhong)含0.1μg。

3.3、48小時(shi)後常規消(xiao)化(hua)細(xi)胞至(zhi)離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，註(zhu)意(yi)培養上(shang)清的(de)漂(piao)浮細(xi)胞也(ye)要收(shou)集(ji)到離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)。

3.4、常規染色(se)體(ti)制(zhi)片（見(jian)第三(san)部(bu)分(fen)：染色(se)體(ti)技術(shu)）。

3.5、染色(se)體(ti)玻片(pian)置(zhi)56℃水浴鍋蓋(gai)上(shang)，鋪上(shang)2×SSC 液，距紫外(wai)燈管(guan)6cm處紫(zi)外(wai)照(zhao)射30分鐘(zhong)。

3.6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

3.7、Giemsa液染色(se)10分(fen)鐘，流水沖洗，晾(liang)幹(gan)。

3.8、鏡(jing)檢(jian)100個分裂相，計**、二、三(san)、四細(xi)胞期分(fen)裂指數。

3.9、計算：

（2）2×SSC配(pei)制(zhi): NaCl 1.75克，檸檬(meng)酸(suan)三鈉(na)·2H2 O 0.88克，加(jia)水至100ml，4℃保存。

附(fu)： （1）BrdU配(pei)制(zhi): BrdU 10mg十雙(shuang)蒸水10ml 4℃下避(bi)光保存。

二(er)、PI染色(se)檢(jian)測細(xi)胞周(zhou)期

1、離(li)心(xin)收(shou)集(ji)細(xi)胞，棄上(shang)清，用(yong)預(yu)冷(leng)PBS洗細(xi)胞兩(liang)次。

2、加(jia)入預(yu)冷(leng)70%乙(yi)醇(chun)，於(yu)4℃固(gu)定(ding)過夜，或(huo)-20℃長(chang)期固(gu)定(ding)（4℃過夜壹般(ban)隔(ge)天就進(jin)行(xing)檢測，如果想(xiang)推遲幾天測(ce)，那就保存在-20℃，有資料說(shuo)-20℃可以保存壹個(ge)月(yue)，個人(ren)建議盡(jin)量(liang)在短時(shi)間內檢(jian)測(ce)，有些(xie)實(shi)驗(yan)是在不同時(shi)間點(dian)上(shang)收(shou)細(xi)胞，這(zhe)時(shi)我就等(deng)*後壹次固(gu)定(ding)完了壹塊(kuai)測(ce)，基(ji)本上(shang)也(ye)多在壹周(zhou)內檢(jian)測(ce)完(wan)畢(bi)，沒有特地(di)去比較(jiao)保存時(shi)間對檢測結果(guo)的(de)影(ying)響）。

3、細(xi)胞染色(se)

離(li)心(xin)收(shou)集(ji)細(xi)胞，以1mL的PBS洗細(xi)胞壹次，加(jia)入500uLPBS含50ug/mL溴化(hua)乙(yi)錠(ding)（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避(bi)光孵(fu)育30分鐘(zhong)（PI我是直接(jie)用(yong)PBS配(pei)成(cheng)工作(zuo)濃度，然(ran)後(hou)加(jia)入細(xi)胞沈澱混(hun)勻(yun)，RNA酶(mei)現加(jia)，但有時(shi)不加(jia)發(fa)現對實驗結果(guo)也(ye)沒太大的(de)影(ying)響(xiang)） 。

4、流式分析(xi)

以標準程(cheng)序用(yong)流式細(xi)胞儀檢測(ce)，壹般(ban)計數2-3萬個(ge)細(xi)胞，結(jie)果(guo)用細(xi)胞周(zhou)期擬(ni)和軟(ruan)件(jian)ModFit分析(xi)。

分析(xi)時(shi)，使(shi)用(yong)FL2-w和(he)FL2-A顯(xian)示(shi)，去除聯體(ti)細(xi)胞。

細(xi)胞周(zhou)期流式後壹般(ban)分(fen)為G0/G1,S,G2/M期三(san)部份，如果有雕亡(wang)，在G0/G1期前(qian)面有個雕(diao)亡峰(feng)(也(ye)稱sub-G0期),而如果分(fen)析(xi)時(shi)細(xi)胞窗口沒設置好，可能在*前面還有細(xi)胞碎(sui)片(pian)峰(feng)。

結果(guo)解讀(du)

G0/G1期細(xi)胞占總(zong)的(de)61.2%，峰(feng)位於(yu)橫座(zuo)標的45.76

G2/M期占13.07，峰(feng)位於(yu)橫座(zuo)標的91.43

S期占25.73

G2/G1為(wei)2.0（即(ji)G2期為(wei)4倍體(ti)細(xi)胞，而G1期為(wei)2倍體(ti)細(xi)胞，比(bi)值(zhi)為2）

峰(feng)的變(bian)異(yi)系(xi)數為4.54%（好）

細(xi)胞碎(sui)片(pian)為0.48%，細(xi)胞聚(ju)集(ji)體(ti)有0.06%。

總的(de)細(xi)胞數（儀器檢(jian)測(ce)到的）為(wei)17525個，

在細(xi)胞周(zhou)期中(zhong)分(fen)析(xi)的細(xi)胞數為17431個(ge)（即(ji)排(pai)除了碎(sui)片及(ji)聚集(ji)體(ti)後）

CV是變(bian)異(yi)系(xi)數。壹般(ban)CV越(yue)小(xiao)，峰(feng)形越(yue)好，越(yue)尖(jian)銳。能(neng)控制(zhi)在5%左右是比(bi)較(jiao)好的結果，壹般(ban)小(xiao)於(yu)10%就可以認可(ke)了。

細(xi)胞雕(diao)亡(wang)

細(xi)胞雕(diao)亡(wang)或稱程(cheng)序性(xing)細(xi)胞死(si)亡(wang)（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xi)胞的(de)生命現象(xiang)之(zhi)壹，它(ta)在機(ji)體(ti)的胚(pei)胎(tai)發(fa)育、組織(zhi)修復(fu)及(ji)自身反(fan)應性(xing)T淋(lin)巴細(xi)胞的(de)清除等(deng)方面起著(zhe)十分(fen)重(zhong)要的作(zuo)用。細(xi)胞雕(diao)亡(wang)調節的(de)失(shi)控可(ke)導致臨(lin)床(chuang)各(ge)種(zhong)疾病的(de)發(fa)生。如老年性(xing)癡(chi)呆與神(shen)經(jing)細(xi)胞雕(diao)亡(wang)過度有關(guan)，自身免疫(yi)性(xing)疾病和(he)腫瘤(liu)與細(xi)胞雕(diao)亡(wang)的抑制(zhi)有關(guan)。細(xi)胞雕(diao)亡(wang)有別(bie)於(yu)細(xi)胞壞(huai)死(si)，它有壹系(xi)列的細(xi)胞形態(tai)學和(he)生物化學的(de)改(gai)變，包括(kuo)出(chu)現染色(se)質濃縮、DNA降(jiang)解、雕(diao)亡小(xiao)體(ti)形成(cheng)等(deng)。在正常的活(huo)細(xi)胞，磷(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨(an)酸(suan)（phosphotidylserine， PS）位於(yu)細(xi)胞膜(mo)的(de)內側(ce)，但(dan)在雕亡的細(xi)胞，PS 從(cong)細(xi)胞膜(mo)的(de)內側(ce)翻(fan)轉(zhuan)到細(xi)胞膜(mo)的(de)表(biao)面，暴露(lu)在細(xi)胞外(wai)環(huan)境(jing)中(zhong)。Annexin-Ⅴ（膜(mo)聯蛋白-V）是壹種(zhong)分子量(liang)為35-36KD的(de)Ca2+ 依(yi)賴(lai)性(xing)磷(lin)脂(zhi)結(jie)合(he)蛋白，能(neng)與(yu)PS高(gao)親(qin)和力(li)結(jie)合。因(yin)此(ci)將Annexin-Ⅴ進(jin)行(xing)熒(ying)光(guang)素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記(ji)，以標記(ji)了的(de)Annexin-Ⅴ作為(wei)探針(zhen)，利(li)用流式細(xi)胞儀或熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡可(ke)檢測(ce)細(xi)胞雕(diao)亡(wang)的發(fa)生。

壹、實(shi)驗(yan)步驟：

1.  雕亡細(xi)胞的(de)制(zhi)備

小(xiao)鼠腹腔(qiang)註射(she)地(di)塞米松(song)25 mg/kg體(ti)重，10 h後(hou)解剖取胸腺(xian)，分離(li)胸(xiong)腺(xian)細(xi)胞。用(yong)PBS洗兩(liang)遍，調整(zheng)待測細(xi)胞的(de)濃度為(wei)2×106 /ml，備(bei)用。

2.  200 μl細(xi)胞懸(xuan)液加(jia)入1 ml冷(leng)PBS，輕輕(qing)震(zhen)蕩(dang)使(shi)細(xi)胞懸(xuan)浮，1000 rpm 4 ℃離(li)心(xin)10 分鐘(zhong)，棄上(shang)清。

3.  重(zhong)復(fu)步驟2兩(liang)次。

4.  將(jiang)細(xi)胞重(zhong)懸(xuan)於(yu)200 μl 標記(ji)緩沖液。

5.  加(jia)入10 μl Annexin V-FITC，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(yun)，避(bi)光室溫反(fan)應15 分(fen)鐘(zhong)或4 ℃反(fan)應30 分(fen)鐘(zhong)。

6.  加(jia)入300 μl標記(ji)緩沖液，立(li)即(ji)上(shang)機(ji)（流式細(xi)胞儀）檢測(ce)。

二(er)、註意(yi)事項：

1.  整(zheng)個操作(zuo)過程(cheng)動作(zuo)要盡(jin)量(liang)輕柔，切勿(wu)用力(li)吹打(da)細(xi)胞，盡(jin)量(liang)在4 ℃下操作。

2.  反(fan)應完(wan)畢(bi)後要盡(jin)快檢測，因(yin)為細(xi)胞雕(diao)亡(wang)是壹個(ge)動(dong)態(tai)的過程(cheng)，反(fan)應壹小(xiao)時(shi)後熒(ying)光(guang)強度(du)就開始衰(shuai)變。

3.  Annexin V-FITC是光(guang)敏(min)物質，在操作時(shi)要註意(yi)避(bi)光。

三、實驗(yan)結(jie)果

用(yong)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡觀(guan)察(cha)，雕(diao)亡(wang)細(xi)胞細(xi)胞膜(mo)上(shang)可見(jian)黃綠(lv)色(se)光(guang)環(huan)。PS轉移(yi)到(dao)細(xi)胞膜(mo)外(wai)不是調(tiao)亡(wang)所特有的，也(ye)可發(fa)生在細(xi)胞壞(huai)死(si)中(zhong)。以FITC標記(ji)的Annexin V, 可以同時(shi)結合(he)使(shi)用(yong)PI（碘(dian)化(hua)丙啶）拒(ju)染法(fa)，用(yong)流式細(xi)胞儀分析(xi)可檢測雕(diao)亡(wang)細(xi)胞的(de)百(bai)分率(lv)。

RTCA實時(shi)監測(ce)腫瘤(liu)細(xi)胞遷(qian)移(yi)及(ji)浸(jin)潤(run)

細(xi)胞因(yin)子檢(jian)測

流式細(xi)胞檢(jian)測(ce)線(xian)粒體(ti)膜電(dian)位

激光(guang)共(gong)聚焦(jiao)免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)檢(jian)測(ce)

合(he)肥合肥星肽生物科技(ji)有限公(gong)司(si) 是致力(li)於(yu)從(cong)事生命科學研(yan)究和提供(gong)高(gao)質量(liang)的生物技術(shu)外(wai)包服務公司(si)（CRO），主(zhu)營(ying)多(duo)肽及(ji)小(xiao)分子等(deng)化合物定制(zhi)合成(cheng)，同時(shi)還擁有自己(ji)開(kai)發(fa)的(de)細(xi)胞株(zhu)、菌(jun)株等(deng)產(chan)品(pin)，並承(cheng)接相(xiang)關(guan)的技(ji)術(shu)服務(wu)以及品(pin)牌(pai)（BIOLOGIX/巴羅(luo)克、DLAB/大龍(long)）產(chan)品(pin)。

24小時(shi)保姆式(shi)服(fu)務售前售後 13295518198（QQ/微(wei)信/電(dian)話(hua)）汪(wang)亞(ya)南(nan)

天(tian)地(di)合氣(qi)，萬(wan)物自生。