標(biao)簽(qian): 限制(zhi)性內切(qie)酶(mei) 消化 DNA
影響限制性(xing)內切(qie)酶(mei)反(fan)應(ying)的(de)因(yin)素(su)很(hen)多。DNA制(zhi)品(pin)中(zhong)的(de)汙染均能(neng)抑(yi)制(zhi)酶(mei)切活性。這種抑(yi)制(zhi)可通(tong)過增(zeng)加酶(mei)作用單位(wei)數(shu)、增(zeng)大反(fan)應(ying)體(ti)枳以(yi)稀(xi)釋可(ke)能(neng)的(de)抑(yi)制(zhi)劑(ji)或延(yan)長反(fan)應(ying)時間(jian)來加以(yi)克(ke)服。
實(shi)驗方(fang)法
進(jin)行(xing)限(xian)制酶(mei)切割反(fan)應(ying)只(zhi)需簡單地(di)將(jiang)酶(mei)和DNA樣品放在合適的(de)反(fan)應(ying)緩(huan)沖(chong)液(ye)溫(wen)育,其(qi)中(zhong)DNA和酶(mei)的(de)量、緩(huan)沖(chong)液(ye)的(de)離子強度、溫(wen)育溫(wen)度和時間(jian)都依(yi)具體(ti)的(de)反(fan)應(ying)而改變。
DNA
TE 酶(mei)切緩(huan)沖(chong)液(ye) EDTA
電泳(yong)儀(yi)
1. 混合下列(lie)溶(rong)液(ye)於壹(yi)個(ge)無(wu)菌(jun)的(de)微(wei)量(liang)離心管中(zhong)
(1)x μl DNA (2)2 μl 10×酶(mei)切緩(huan)沖(chong)液(ye) (3)18-x μl H2O
(4)20 μl 的(de)反(fan)應(ying)體(ti)積可以(yi)方(fang)便(bian)地(di)用於聚丙(bing)烯(xi)酰胺(an)或瓊脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)分析。 (5)只(zhi)要反(fan)應(ying)混合物中(zhong)其(qi)他成分的(de)比例保(bao)持壹定(ding),可(ke)增(zeng)減(jian)待(dai)切割DNA的(de)量和反(fan)應(ying)條件(jian)。
2. 加入限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)(1~5 U/μg DNA)在推薦(jian)的(de)溫(wen)度溫(wen)育1 h (—般(ban)是(shi)37℃)。 3. 理論上(shang),1 U 限制(zhi)性內(nei)切(qie)酶(mei)在推薦(jian)的(de)反(fan)應(ying)條件(jian)下,60 min 內(nei)可完全(quan)消化1 μg 純(chun)化的(de)樣品。 4. 酶(mei)的(de)體(ti)積應低(di)於反(fan)應(ying)總體(ti)積的(de)1/10,因(yin)為(wei)酶(mei)液(ye)中(zhong)的(de)可以(yi)幹(gan)擾(rao)反(fan)應(ying)。
5. 加入5 μl 電泳(yong)加樣緩(huan)沖(chong)液(ye)終止(zhi)反(fan)應(ying),進行(xing)瓊脂糖或聚丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電泳(yong)。
6. 反(fan)應(ying)也可(ke)通(tong)過加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA(終(zhong)濃(nong)度為(wei)12. 5 mol/l) 以(yi)螯(ao)合鎂離於而終(zhong)止(zhi)。 7. 很(hen)多(duo)酶(mei)再65℃溫(wen)育10 min 可(ke)被不可逆(ni)滅(mie)活,有些(xie)不能(neng)在65℃熱失(shi)活的(de)酶(mei)在75℃溫(wen)育15 min 也(ye)能(neng)失活。 8. 如(ru)果(guo)酶(mei)對熱具完全(quan)抗性(xing),可遍過酚抽(chou)提和乙(yi)醇(chun)沈(chen)澱或通(tong)過矽(gui)基(ji)質懸(xuan)浮(fu)法(fa)來純(chun)化DNA。
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