DNA實(shi)驗技術(shu)：限(xian)制(zhi)性內切(qie)酶(mei)消化DNA實(shi)驗

進(jin)行(xing)限(xian)制酶(mei)切割反(fan)應(ying)只(zhi)需簡單地(di)將(jiang)酶(mei)和DNA樣品放在合適的(de)反(fan)應(ying)緩(huan)沖(chong)液(ye)溫(wen)育，其(qi)中(zhong)DNA和酶(mei)的(de)量、緩(huan)沖(chong)液(ye)的(de)離子強度、溫(wen)育溫(wen)度和時間(jian)都依(yi)具體(ti)的(de)反(fan)應(ying)而改變。

DNA

TE 酶(mei)切緩(huan)沖(chong)液(ye) EDTA

電泳(yong)儀(yi)

1.  混合下列(lie)溶(rong)液(ye)於壹(yi)個(ge)無(wu)菌(jun)的(de)微(wei)量(liang)離心管中(zhong)

（1）x μl  DNA
（2）2 μl  10×酶(mei)切緩(huan)沖(chong)液(ye)
（3）18-x μl  H₂O

（4）20 μl 的(de)反(fan)應(ying)體(ti)積可以(yi)方(fang)便(bian)地(di)用於聚丙(bing)烯(xi)酰胺(an)或瓊脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)分析。
（5）只(zhi)要反(fan)應(ying)混合物中(zhong)其(qi)他成分的(de)比例保(bao)持壹定(ding)，可(ke)增(zeng)減(jian)待(dai)切割DNA的(de)量和反(fan)應(ying)條件(jian)。

2.  加入限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)（1~5 U/μg DNA）在推薦(jian)的(de)溫(wen)度溫(wen)育1 h （—般(ban)是(shi)37℃）。
3.  理論上(shang)，1 U 限制(zhi)性內(nei)切(qie)酶(mei)在推薦(jian)的(de)反(fan)應(ying)條件(jian)下，60 min 內(nei)可完全(quan)消化1 μg 純(chun)化的(de)樣品。
4.  酶(mei)的(de)體(ti)積應低(di)於反(fan)應(ying)總體(ti)積的(de)1/10，因(yin)為(wei)酶(mei)液(ye)中(zhong)的(de)可以(yi)幹(gan)擾(rao)反(fan)應(ying)。

5.  加入5 μl 電泳(yong)加樣緩(huan)沖(chong)液(ye)終止(zhi)反(fan)應(ying)，進行(xing)瓊脂糖或聚丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電泳(yong)。

6.  反(fan)應(ying)也可(ke)通(tong)過加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（終(zhong)濃(nong)度為(wei)12. 5 mol/l） 以(yi)螯(ao)合鎂離於而終(zhong)止(zhi)。
7.  很(hen)多(duo)酶(mei)再65℃溫(wen)育10 min 可(ke)被不可逆(ni)滅(mie)活，有些(xie)不能(neng)在65℃熱失(shi)活的(de)酶(mei)在75℃溫(wen)育15 min 也(ye)能(neng)失活。
8.  如(ru)果(guo)酶(mei)對熱具完全(quan)抗性(xing)，可遍過酚抽(chou)提和乙(yi)醇(chun)沈(chen)澱或通(tong)過矽(gui)基(ji)質懸(xuan)浮(fu)法(fa)來純(chun)化DNA。