壹(yi)、原(yuan)理(li)
質(zhi)粒DNA粘附(fu)在細菌(jun)細胞(bao)表面(mian)，經(jing)過(guo)42°C短時(shi)間(jian)的(de)熱(re)擊處(chu)理(li)，促(cu)進(jin)吸(xi)收(shou)DNA.然後(hou)在非(fei)選擇(ze)培養基中(zhong)培養壹代，待(dai)質(zhi)粒上(shang)所帶(dai)的(de)抗(kang)菌(jun)素(su)基因(yin)表達，就可(ke)以在含抗(kang)菌(jun)素(su)的培養基中(zhong)生(sheng)長。
二、器材
旋渦混合(he)器，微(wei)量移(yi)液(ye)取樣(yang)器，移液(ye)器吸頭(tou)，1.5ml 微(wei)量離(li)心(xin)管，雙面(mian)微(wei)量離(li)心(xin)管架，幹(gan)式恒溫氣浴（或(huo)恒溫(wen)水浴鍋），制冰機，恒溫(wen)搖床，培養皿（已鋪好(hao)固體LB-Amp），超(chao)凈(jing)工(gong)作(zuo)臺(tai)，酒(jiu)精燈(deng)，玻璃(li)塗(tu)棒，恒(heng)溫培養箱。
三、試劑(ji)
培養基（不(bu)加抗(kang)菌(jun)素(su)），LB培養基（加(jia)抗(kang)菌(jun)素(su)），無(wu)菌(jun)ddH2O,IPTG,X-gal.
四(si)、實(shi)驗準(zhun)備(bei)
無(wu)菌(jun)ddH2O，1.5ml離(li)心(xin)管裝(zhuang)入鋁(lv)制飯(fan)盒（滅菌(jun)）、移(yi)液器吸頭(tou)裝(zhuang)入相(xiang)應(ying)的吸(xi)頭盒（滅菌(jun)），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用(yong)N,N-二甲基甲酰(xian)胺(an)配）。
五(wu)、操作(zuo)步(bu)驟
（1）事先(xian)將(jiang)恒溫(wen)水浴的溫(wen)度調到(dao)42℃。
（2）從(cong)-70℃ 超(chao)低(di)溫(wen)冰櫃中(zhong)取出壹管（100μl）感受態菌(jun)，立(li)即用(yong)手指加溫(wen)融(rong)化後插(cha)入冰上(shang)，冰浴5~10min。
（3） 加入(ru)5μl連(lian)接好(hao)的質(zhi)粒(li)混合(he)液(ye)（DNA含(han)量不(bu)超(chao)過(guo)100ng），輕(qing)輕(qing)震蕩後放置(zhi)冰上(shang)20min。
（4） 輕(qing)輕(qing)搖(yao)勻後(hou)插(cha)入(ru)42℃水浴中1~2min進(jin)行(xing)熱(re)休(xiu)克，然後(hou)迅速(su)放回(hui)冰中(zhong)，靜(jing)置3~5min。
（5） 在超(chao)凈(jing)工(gong)作(zuo)臺(tai)中(zhong)向(xiang)上(shang)述各(ge)管(guan)中(zhong)分(fen)別加(jia)入500μl LB培養基（不(bu)含抗(kang)菌(jun)素(su)）輕(qing)輕(qing)混(hun)勻，然後(hou)固定(ding)到(dao)搖(yao)床的(de)彈簧架上(shang)37℃震蕩1h.
（6） 在超(chao)凈(jing)工(gong)作(zuo)臺(tai)中(zhong)取(qu)上(shang)述轉化(hua)混合(he)液(ye)100~300μl，分(fen)別滴到(dao)含合(he)適(shi)抗(kang)菌(jun)素(su)的固體LB平(ping)板(ban)培養皿中(zhong)，用(yong)酒(jiu)精燈(deng)燒(shao)過(guo)的玻璃(li)塗(tu)布棒塗(tu)布均(jun)勻（註意：玻璃(li)塗(tu)布棒上(shang)的酒(jiu)精熄(xi)滅(mie)後稍(shao)等片刻，待(dai)其(qi)冷(leng)卻後再塗(tu)）。
（7） 如果載體和(he)宿(xiu)主(zhu)菌(jun)適(shi)合(he)藍(lan)白(bai)斑(ban)篩選(xuan)的(de)話(hua)，滴完(wan)菌(jun)液(ye)後再在平板(ban)上(shang)滴加(jia)40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用(yong)酒(jiu)精燈(deng)燒(shao)過(guo)的玻璃(li)塗(tu)布棒塗(tu)布均(jun)勻。
（8） 在塗(tu)好(hao)的培養皿上(shang)做(zuo)上(shang)標(biao)記(ji)，先(xian)放置(zhi)在37℃恒溫(wen)培養箱中30-60min直到表(biao)面(mian)的(de)液體都滲透到培養基裏(li)後(hou)，再倒(dao)置過(guo)來(lai)放入(ru)37℃恒溫(wen)培養箱過(guo)夜(ye)。
（9） 在被(bei)細菌(jun)汙染的(de)桌面(mian)上(shang)噴灑70%乙醇(chun)，擦幹(gan)桌面(mian)，寫(xie)實(shi)驗報(bao)告(gao)。
（10）觀(guan)察(cha)平(ping)板(ban)上(shang)長出的菌(jun)落克隆，以菌(jun)落之(zhi)間能(neng)互相(xiang)分(fen)開(kai)為好(hao)。註意白(bai)色(se)菌(jun)斑(ban)
