實(shi)驗(yan)十(shi)四(si) 細胞(bao)集落(luo)形(xing)成(cheng)實(shi)驗(yan)
非(fei)整倍(bei)體(ti)無(wu)限細胞(bao)系和(he)癌細胞(bao)株中，仍(reng)然(ran)存在不(bu)同(tong)細胞(bao)亞(ya)群(qun)，它們的功(gong)能和(he)生長特(te)點有(you)些差異，其(qi)中(zhong)有(you)些亞(ya)群(qun)細胞(bao)對培(pei)養(yang)環境(jing)有(you)較大的適(shi)應性(xing)和(he)具(ju)有(you)較強的獨(du)立(li)生存能力，細胞(bao)集落(luo)率高(gao)。純化細胞(bao)群來(lai)自(zi)壹(yi)個共(gong)同(tong)的祖細胞(bao)，細胞(bao)遺(yi)傳性(xing)狀(zhuang)、生物(wu)學特(te)性(xing)相(xiang)似，利於(yu)實(shi)驗(yan)研(yan)究。原(yuan)代培(pei)養細胞(bao)和(he)二倍(bei)體(ti)有(you)限細胞(bao)系，細胞(bao)集落(luo)率很低。細胞(bao)集落(luo)化培養(yang)之前(qian)，應先測(ce)定細胞(bao)集落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv)，以了(le)解(jie)細胞(bao)在極低密(mi)度條件(jian)下(xia)的生長能力。
目(mu)前(qian)認(ren)為僅(jin)有(you)腫(zhong)瘤(liu)幹細胞(bao)具(ju)有(you)形(xing)成(cheng)集(ji)落(luo)的能力，集落(luo)抑制(zhi)率(lv)常用(yong)於(yu)**藥(yao)物(wu)敏感試(shi)驗、腫(zhong)瘤(liu)放(fang)射(she)生物(wu)學試(shi)驗。
集(ji)落(luo)抑制(zhi)率(lv)=（1-（實(shi)驗(yan)組集(ji)落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv)/對照(zhao)組集(ji)落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv)））×100%
（壹(yi)）原理
細胞(bao)集落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv) 單個(ge)細胞(bao)在體(ti)外增殖(zhi)6代以上，其(qi)後代所(suo)組成(cheng)的細胞(bao)群體(ti)，稱(cheng)為集(ji)落(luo)或克隆。每(mei)個克隆含有(you)50個以上的細胞(bao)，大小(xiao)在0.3-1.0mm 之(zhi)間(jian)。集落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv)表示(shi)細胞(bao)獨立(li)生存能力。常用(yong)方(fang)法(fa)有(you)平(ping)板集落(luo)形(xing)成(cheng)試(shi)驗、軟(ruan)瓊(qiong)脂(zhi)集落(luo)形(xing)成(cheng)試(shi)驗。
（二(er)）實(shi)驗(yan)用(yong)品(pin)
1.材(cai)料(liao)：Hela細胞(bao)。
2.器(qi)材(cai)：（直(zhi)徑 60mm ）培(pei)養皿(min)、細胞(bao)記數板、燒(shao)杯、吸(xi)管(guan)、離心(xin)機、離心(xin)管(guan)、廢液(ye)瓶(ping)、倒置顯(xian)微(wei)鏡(jing)、二氧(yang)化碳培(pei)養箱、超(chao)凈(jing)工作臺、水(shui)浴(yu)鍋(guo)。
3.試(shi)劑(ji)：Giemsa染(ran)液(ye)、0.25%胰蛋(dan)白酶(mei)消(xiao)化液(ye)、血清(qing)細胞(bao)培養(yang)液(ye)、安爾碘(dian)、瓊(qiong)脂(zhi)。
（三(san)）方法(fa)
1.平(ping)板克隆形(xing)成(cheng)試(shi)驗
本(ben)法(fa)適(shi)用(yong)於(yu)貼(tie)壁(bi)生長的細胞(bao)，包括培養(yang)的正(zheng)常(chang)細胞(bao)和(he)腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)。
(1)對(dui)指數生長期細胞(bao)，采(cai)用(yong)常(chang)規(gui)消(xiao)化傳代方(fang)法(fa)，制成(cheng)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)。
(2)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)反(fan)復(fu)吹打(da)，使細胞(bao)充(chong)分分散(san)，單(dan)個(ge)細胞(bao)百分率(lv)應(ying)在95%以上。細胞(bao)記數，並用(yong)培(pei)養(yang)基調(tiao)節(jie)細胞(bao)濃度，待(dai)用(yong)。
(3)根據細胞(bao)增殖(zhi)能力，將細胞(bao)懸(xuan)液(ye)倍比稀(xi)釋。壹(yi)般按照(zhao)每(mei)皿含(han)50、100、200個細胞(bao)的濃(nong)度分別接種5ml細胞(bao)懸(xuan)液(ye)到培(pei)養(yang)皿(min)（直徑 60mm ）中(zhong)，以十(shi)字(zi)方向輕(qing)輕(qing)晃動(dong)培(pei)養(yang)皿(min)，使細胞(bao)分散(san)均(jun)勻。
(4)培(pei)養皿(min)置 37℃ 、5%CO2中培養2~3周(zhou)，中(zhong)間(jian)根據培養液(ye)pH變化適(shi)時更換新(xin)鮮(xian)培養(yang)液(ye)。
(5)當(dang)培(pei)養皿中出(chu)現肉(rou)眼(yan)可見(jian)克隆時，終(zhong)止培養(yang)，棄(qi)去培養(yang)液(ye)，PBS液(ye)小(xiao)心(xin)浸(jin)洗(xi)2次，空氣幹(gan)燥(zao)。甲(jia)醇固(gu)定15分鐘(zhong)，棄(qi)甲(jia)醇後空氣幹(gan)燥(zao)。用(yong)Giemsa染(ran)液(ye)染(ran)色10分鐘(zhong)，流(liu)水(shui)緩慢(man)洗(xi)去染(ran)液(ye)，空氣幹(gan)燥(zao)。
2.軟(ruan)瓊(qiong)脂(zhi)集落(luo)形(xing)成(cheng)試(shi)驗
本(ben)法(fa)適(shi)用(yong)於(yu)非(fei)錨著依賴(lai)性(xing)生長的細胞(bao)，如(ru)骨(gu)髓造血(xue)幹細胞(bao)、腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)株、轉化細胞(bao)系。利(li)用(yong)瓊(qiong)脂(zhi)液(ye)無(wu)粘(zhan)著(zhe)性(xing)又(you)可凝(ning)固(gu)的特(te)性(xing)，將(jiang)腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)混入瓊脂(zhi)液(ye)中，瓊(qiong)脂(zhi)液(ye)凝(ning)固(gu)使(shi)腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)置於(yu)壹(yi)定位置，瓊(qiong)脂(zhi)中腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)可能向周圍(wei)作全(quan)方(fang)位的移動(dong)，因(yin)此可(ke)以用(yong)來(lai)檢(jian)測(ce)腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)的主動(dong)移動(dong)能力。腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)在適(shi)宜培養(yang)基中又(you)可以增殖(zhi)，從而可以測(ce)定腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)克隆形(xing)成(cheng)率(lv)。造血(xue)系(xi)統軟(ruan)瓊(qiong)脂(zhi)集落(luo)形(xing)成(cheng)試(shi)驗方(fang)法(fa)相(xiang)同(tong)，主要用(yong)於(yu)有(you)關(guan)細胞(bao)分化的研(yan)究，但使(shi)用(yong)培(pei)養(yang)基不(bu)同(tong)。
（1）同(tong)上(shang)（1）~（3）步(bu)驟。
（2）調(tiao)整細胞(bao)懸(xuan)液(ye)密度為1×103個(ge)/ml細胞(bao)。
（3）制(zhi)備底(di)層(ceng)瓊(qiong)脂(zhi)，完(wan)全(quan)溶化的5%瓊(qiong)脂(zhi)和(he) 37℃ 左(zuo)右預(yu)溫(wen)的新(xin)鮮(xian)完(wan)全(quan)培(pei)養(yang)液(ye)以1：9比例在 40℃ 均(jun)勻混合(he)，加入培養皿（直(zhi)徑 60mm ）中(zhong)，每(mei)皿含(han)0.5%瓊脂(zhi)培養基2ml，室溫(wen)下瓊(qiong)脂(zhi)完(wan)全(quan)凝(ning)固(gu)。
（4）制(zhi)備上層瓊脂(zhi),取(qu) 37℃ 不(bu)同(tong)密(mi)度梯度(按照(zhao)每(mei)皿含(han)50、100、200個)的細胞(bao)懸(xuan)液(ye)1.5ml移入小(xiao)燒(shao)杯中，加入 40℃ 、5%瓊脂(zhi)等(deng)體(ti)積(ji)混勻，即成(cheng)0.25%半(ban)固(gu)體(ti)瓊(qiong)脂(zhi)培養基。配好的半(ban)固(gu)體(ti)瓊(qiong)脂(zhi)培養基立即加入鋪有(you)底(di)層(ceng)瓊(qiong)脂(zhi)的培(pei)養(yang)皿中(zhong)，室(shi)溫(wen)下瓊(qiong)脂(zhi)凝(ning)固(gu)。 37℃ 、5%CO2靜置培養2-3周(zhou)。
（四(si)）實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)
1.定期(qi)觀(guan)察細胞(bao)培養(yang)過(guo)程(cheng)中集(ji)落(luo)的形(xing)成(cheng)。
2.顯(xian)微(wei)鏡(jing)下計(ji)數大於(yu)50個(ge)細胞(bao)克隆數，然(ran)後按下(xia)式(shi)計(ji)算集落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv)：
集(ji)落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv)（%）=（集落(luo)數/接種細胞(bao)數）×100
（五(wu)）註意(yi)事項(xiang)
1.瓊(qiong)脂(zhi)對熱和(he)酸不(bu)穩定，如(ru)果(guo)反(fan)復(fu)加熱，容易降解，產生毒性(xing)，同(tong)時(shi)瓊脂(zhi)硬度下降。故瓊脂(zhi)高(gao)壓滅菌( 10磅 15分鐘(zhong))後按壹(yi)次用(yong)量(liang)進行(xing)分裝(zhuang)。
2.細胞(bao)懸(xuan)液(ye)中，細胞(bao)分散(san)度>95%。
3.軟(ruan)瓊(qiong)脂(zhi)培養時(shi)，註意(yi)瓊脂(zhi)與細胞(bao)混合(he)時溫(wen)度不(bu)要超(chao)過 40℃ ，以免(mian)**細胞(bao)。
4.接種細胞(bao)密度不(bu)宜過高(gao)。
5.細胞(bao)在低(di)密(mi)度條件(jian)下(xia)培養(yang)，生存率明(ming)顯下(xia)降，無(wu)限細胞(bao)系和(he)腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)株克隆形(xing)成(cheng)率(lv)壹(yi)般在10%以上。但初(chu)代培(pei)養細胞(bao)和(he)有(you)限細胞(bao)系僅(jin)為(wei)0.5~5%,甚至為(wei)零(ling)。為提(ti)高(gao)集(ji)落(luo)形(xing)成(cheng)率(lv)，必要(yao)時在培(pei)養(yang)基中添加胰島素、地塞米(mi)松等(deng)促細胞(bao)克隆形(xing)成(cheng)物(wu)質。
（六(liu)）復(fu)習思考(kao)題
比較平(ping)板克隆形(xing)成(cheng)試(shi)驗和(he)軟(ruan)瓊(qiong)脂(zhi)集落(luo)形(xing)成(cheng)試(shi)驗的異(yi)同(tong)。
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