DNA專(zhuan)題(ti)：從動(dong)物(wu)肝(gan)臟中(zhong)提(ti)取DNA

壹(yi)、原理(li) ：
       在(zai)濃(nong)氯化(hua)鈉(na)（1―2mol/L）溶液(ye)中(zhong)，脫氧核(he)糖核(he)蛋白(bai)的溶解度(du)很大，核(he)糖核(he)蛋白(bai)的溶解度(du)很小，在(zai)稀(xi)氯化(hua)鈉(na)（0.14 mol/L）溶液(ye)中(zhong)，脫氧核(he)糖核(he)蛋白(bai)的溶解度(du)很小，核(he)糖核(he)蛋白(bai)的溶解度(du)很大。因(yin)此(ci)，可(ke)利(li)用不(bu)同(tong)濃度(du)的氯化(hua)鈉(na)溶液(ye)，將(jiang)脫氧核(he)糖核(he)蛋白(bai)和核(he)糖核(he)蛋白(bai)從樣(yang)品中(zhong)分別(bie)抽(chou)提(ti)出(chu)來(lai)。
      將(jiang)抽(chou)提(ti)得的核(he)蛋白(bai)用SDS（十二(er)烷(wan)基硫酸鈉(na)）處理(li)，DNA或(huo)（RNA）即(ji)與蛋(dan)白(bai)質分開，可用氯仿(fang)―異(yi)戊(wu)醇將(jiang)蛋白(bai)質沈(chen)澱除去，而DNA則溶解於溶液(ye)中(zhong)。向(xiang)溶液(ye)中(zhong)加(jia)入適量乙(yi)醇，DNA即(ji)析出(chu)。
為了防(fang)止DNA或(huo)（RNA）酶解(jie)，提(ti)取時加(jia)入EDTA（乙(yi)二(er)胺(an)四(si)乙(yi)酸）

      二(er)、實(shi)驗材料(liao)與儀(yi)器 ：
      1、小白(bai)鼠(shu)肝(gan)臟
      2、勻(yun)漿(jiang)器(qi)
      3、離(li)心機(ji)5000r/min
      4、量(liang)筒(tong)50ml（×1），25 ml（×1），10 ml（×1）
      5、吸(xi)管5 ml（×2）
      6、水(shui)浴(yu)鍋
      7、真(zhen)空幹燥器

      三(san)、試劑 ：
      1．5 mol/L NaCl 溶液(ye)：將(jiang)292.3g NaCl 溶於水(shui)，稀釋(shi)至(zhi)1000ml。
      2．0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA―Na 溶液(ye)：溶8.18g NaCL 及(ji)37.2g EDTA―Na 於蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，稀釋(shi)至(zhi)1000ml。
      3．25% SDS 溶液(ye)：溶25g 十二(er)烷(wan)基硫酸鈉(na)於100ml 45% 乙(yi)醇
      4．0.015 mol/L NaCL―0.0015 mol/L 檸(ning)檬酸三(san)鈉(na)溶液(ye)：氯化(hua)鈉(na) 0.828 g及(ji)檸(ning)檬酸三(san)鈉(na)0.341g 溶於蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，稀釋(shi)至(zhi)1000ml。
      5．氯仿(fang)―異(yi)戊(wu)醇混合(he)液(ye)：氯仿(fang)：異(yi)戊(wu)醇=24：1（V/V）。
      6．1.5 mol/L NaCL―0.15 mol/L檸(ning)檬酸三(san)鈉(na)溶液(ye)：氯化(hua)鈉(na) 82.8 g 及(ji)檸(ning)檬酸三(san)鈉(na)34.1 g溶於蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，稀釋(shi)至(zhi)1000ml。
      7．3 mol/L乙(yi)醇鈉(na)―0.001 mol/L EDTA―Na溶液(ye)：稱(cheng)取乙(yi)酸鈉(na) 408 g，EDTA―Na 0.372g 溶於蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，稀釋(shi)至(zhi)1000ml。
      8．70%乙(yi)醇，80%乙(yi)醇，95%乙(yi)醇，無(wu)水(shui)乙(yi)醇。
      9．二(er)苯(ben)胺(an)試(shi)劑
      10．1 mol/L過(guo)氯酸溶液(ye)：將(jiang)10ml過氯酸（70%）用蒸(zheng)餾(liu)水(shui)稀釋(shi)至(zhi)110ml。

      四(si)、操(cao)作 ：

      1． DNA的分離純(chun)化(hua)：
      （1）將(jiang)10頭小白(bai)鼠(shu)迅(xun)速殺死，取出(chu)肝(gan)臟，用0.14mol/LNaCl―0.15mol/l EDTA溶液(ye)洗去血(xue)漿，剪碎(sui)，加(jia)入50ml0.14mol/L NaCl―0.15mol/lEDTA溶液(ye)，置勻(yun)漿(jiang)器(qi)中(zhong)研(yan)磨，待磨成糊(hu)狀(zhuang)後，將(jiang)糊(hu)狀(zhuang)物離(li)心10分鐘（4000r/min），棄去上(shang)清(qing)液(ye)，沈(chen)澱用0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液(ye)洗二(er)、三(san)次，所(suo)得(de)沈(chen)澱為脫氧核(he)糖核(he)蛋白(bai)粗制品。
      （2）向(xiang)上述(shu)沈(chen)澱物加(jia)入0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液(ye)，使(shi)總(zong)體積為44ml，然後(hou)滴加(jia)25% SDS溶液(ye) 3ml，邊加(jia)邊攪(jiao)拌，加(jia)畢(bi)，置60水(shui)浴(yu)保溫(wen)10分鐘（不(bu)停攪(jiao)拌）溶液(ye)變的粘稠(chou)並(bing)略透明，取出(chu)冷(leng)至室溫(wen)。此(ci)步(bu)操(cao)作是使核(he)酸與(yu)蛋白(bai)質分離。
      （3）加(jia)入5mol/LNaCL10ml，使(shi)NaCl *終濃(nong)度(du)達到1mol/L，攪(jiao)拌10分鐘，加(jia)入月(yue)約(yue)壹倍體積的氯仿(fang)―異(yi)戊(wu)醇混合(he)溶液(ye)，振(zhen)搖20分鐘，離心10分鐘（4000r/min）。去掉(diao)沈(chen)澱，上層清(qing)液(ye)徐(xu)徐(xu)加(jia)入1.5―2倍95%乙(yi)醇，DNA沈(chen)澱即(ji)析出(chu)，用玻棒(bang)慢(man)慢(man)攪(jiao)動，則DNA絲狀(zhuang)物即(ji)纏在(zai)玻(bo)棒(bang)上(shang)。
      （4）將(jiang)DNA粗品置於27ml 0.015 mol/L NaCl ―0.0015 mol/L檸(ning)檬酸三(san)鈉(na)溶液(ye)中(zhong)，再加(jia)入3ml1.5 mol/L NaCl―0.15 mol/L檸(ning)檬酸三(san)鈉(na)溶液(ye)，攪(jiao)勻(yun),加(jia)入壹(yi)倍體積氯仿(fang)―異(yi)戊(wu)醇混合(he)液(ye)，振(zhen)搖十分鐘，離心（4000r/min，10分鐘），傾出(chu)上層(ceng)液(ye)體(ti)（沈(chen)澱棄去），加(jia)入1.5倍體積95%乙(yi)醇，DNA即(ji)沈(chen)澱析出(chu)。離心，棄去上(shang)清(qing)液(ye)，沈(chen)澱（粗DNA）按(an)本(ben)操(cao)作步驟(zhou)重復處(chu)理(li)壹次(ci)。
      （5）將(jiang)上步(bu)所得沈(chen)澱於27ml 0.015 mol/L NaCl―0.0015 mol/L檸(ning)檬酸三(san)鈉(na)溶液(ye)中(zhong)，然(ran)後以線(xian)狀(zhuang)徐(xu)徐(xu)加(jia)入2倍95%乙(yi)醇，邊加(jia)邊攪(jiao)，取出(chu)絲狀(zhuang)DNA，依次(ci)用70%，80%，95%以及(ji)無(wu)水(shui)乙(yi)醇各(ge)洗壹次(ci)，真空(kong)幹(gan)燥(zao)。

2．鑒定(ding)：用二(er)苯(ben)胺(an)法(fa)測(ce)定(ding)DNA。

合(he)肥合(he)肥星肽生(sheng)物(wu)科技(ji)有(you)限(xian)公(gong)司

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