人成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）酶(mei)聯免(mian)疫(yi)分析(xi)

人成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）酶(mei)聯免(mian)疫(yi)分析(xi)

試劑盒使(shi)用(yong)說(shuo)明(ming)書

本試劑僅供(gong)研究(jiu)使用(yong)       目(mu)的(de)：本試劑盒用(yong)於(yu)測(ce)定(ding)人血(xue)清(qing)，血(xue)漿(jiang)及相關液(ye)體(ti)樣(yang)本中成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）的(de)含量(liang)。

實驗(yan)原理(li)：

本試劑盒應(ying)用(yong)雙抗(kang)體(ti)夾(jia)心法測(ce)定(ding)標(biao)本中人成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）水(shui)平(ping)。用(yong)純(chun)化的(de)人成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）抗(kang)體(ti)包(bao)被(bei)微孔板，制成固(gu)相抗(kang)體(ti)，往(wang)包(bao)被(bei)單(dan)抗的(de)微孔中依次加入(ru)成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）,再(zai)與(yu)HRP標(biao)記(ji)的(de)FGF-23抗(kang)體(ti)結(jie)合，形成抗體(ti)-抗(kang)原-酶(mei)標抗(kang)體(ti)復(fu)合物(wu)，經過徹底(di)洗(xi)滌(di)後(hou)加(jia)底(di)物(wu)TMB顯(xian)色。TMB在(zai)HRP酶(mei)的(de)催化下(xia)轉(zhuan)化(hua)成藍(lan)色，並在(zai)酸(suan)的(de)作用(yong)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成*終的(de)黃色。顏色的(de)深淺和(he)樣(yang)品中的(de)成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）呈(cheng)正(zheng)相(xiang)關(guan)。用(yong)酶(mei)標儀在450nm波(bo)長(chang)下(xia)測(ce)定(ding)吸(xi)光(guang)度(du)（OD值(zhi)），通(tong)過標(biao)準曲線計(ji)算樣(yang)品中人成纖維細胞生(sheng)長(chang)因子23（FGF-23）濃(nong)度(du)。 

試劑盒組成：

樣(yang)本處(chu)理及(ji)要求：

1. 血(xue)清(qing)：室(shi)溫(wen)血液(ye)自(zi)然(ran)凝(ning)固(gu)10-20分(fen)鐘(zhong)，離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔(zai)細(xi)收(shou)集上清(qing)，保(bao)存(cun)過程(cheng)中如出現沈(chen)澱，應(ying)再(zai)次離心。

2. 血(xue)漿(jiang)：應(ying)根據(ju)標本的(de)要求選(xuan)擇EDTA或(huo)檸(ning)檬酸鈉(na)作為抗凝(ning)劑，混(hun)合10-20分(fen)鐘(zhong)後(hou)，離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔(zai)細(xi)收(shou)集上清(qing)，保(bao)存(cun)過程(cheng)中如有(you)沈澱形成，應(ying)該再(zai)次離心。

3. 尿(niao)液(ye)：用(yong)無(wu)菌管(guan)收集(ji)，離心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔(zai)細(xi)收(shou)集上清(qing)，保(bao)存(cun)過程(cheng)中如有(you)沈澱形成，應(ying)再(zai)次離心。胸腹(fu)水(shui)、腦(nao)脊(ji)液(ye)參照實行(xing)。

4. 細(xi)胞(bao)培養上(shang)清(qing)：檢(jian)測(ce)分泌性(xing)的(de)成份(fen)時(shi)，用(yong)無(wu)菌管(guan)收集(ji)。離心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔(zai)細(xi)收(shou)集上清(qing)。檢(jian)測(ce)細胞內(nei)的(de)成份(fen)時(shi)，用(yong)PBS（PH7.2-7.4）稀(xi)釋(shi)細胞(bao)懸液(ye)，細胞(bao)濃(nong)度(du)達到(dao)100萬(wan)/ml左(zuo)右(you)。通(tong)過反(fan)復(fu)凍(dong)融，以(yi)使細(xi)胞破(po)壞並放(fang)出細(xi)胞內(nei)成份(fen)。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔(zai)細(xi)收(shou)集上清(qing)。保(bao)存(cun)過程(cheng)中如有(you)沈澱形成，應(ying)再(zai)次離心。

5. 組織標本：切割(ge)標(biao)本後，稱取(qu)重(zhong)量(liang)。加(jia)入(ru)壹定(ding)量(liang)的(de)PBS，PH7.4。用(yong)液(ye)氮(dan)迅(xun)速(su)冷(leng)凍保存(cun)備用(yong)。標(biao)本融化後(hou)仍然(ran)保持(chi)2-8℃的(de)溫度(du)。加(jia)入(ru)壹定(ding)量(liang)的(de)PBS（PH7.4），用(yong)手工或(huo)勻漿器(qi)將標本勻漿充(chong)分(fen)。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔(zai)細(xi)收(shou)集上清(qing)。分(fen)裝後壹(yi)份(fen)待檢測，其(qi)余冷凍備用(yong)。

6. 標(biao)本采集後盡(jin)早(zao)進行(xing)提(ti)取(qu)，提取(qu)按相(xiang)關(guan)文(wen)獻進行(xing)，提(ti)取(qu)後應(ying)盡(jin)快(kuai)進行(xing)實驗(yan)。若不能(neng)馬(ma)上(shang)進行(xing)試驗(yan)，可(ke)將標本放於-20℃保(bao)存(cun)，但應(ying)避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融.

7. 不能(neng)檢(jian)測(ce)含NaN3的(de)樣(yang)品，因(yin)NaN3抑(yi)制(zhi)辣(la)根(gen)過氧(yang)化物(wu)酶(mei)的(de)（HRP）活(huo)性(xing)。

操(cao)作(zuo)步驟：

1. 標(biao)準品的(de)稀(xi)釋(shi)與(yu)加(jia)樣(yang)：在酶(mei)標包(bao)被板上設標準品孔10孔，在**、**孔中分別加(jia)標(biao)準品100μl，然(ran)後在(zai)**、**孔中加標準品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻；然(ran)後從(cong)**孔、**孔中各(ge)取(qu)100μl分(fen)別(bie)加(jia)到(dao)第(di)三孔和(he)第(di)四孔，再(zai)在(zai)第(di)三、第(di)四孔分別加(jia)標準品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻；然(ran)後在(zai)第(di)三孔和(he)第(di)四孔中先各(ge)取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)，再(zai)各(ge)取(qu)50μl分(fen)別(bie)加(jia)到(dao)第(di)五、第(di)六孔中，再(zai)在(zai)第(di)五、第(di)六孔中分別加(jia)標(biao)準品稀(xi)釋(shi)液(ye)50ul，混(hun)勻；混(hun)勻後(hou)從第(di)五、第(di)六孔中各(ge)取(qu)50μl分(fen)別(bie)加(jia)到(dao)第(di)七(qi)、第(di)八孔中，再(zai)在(zai)第(di)七(qi)、第(di)八孔中分別加(jia)標(biao)準品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻後(hou)從第(di)七(qi)、第(di)八孔中分別取(qu)50μl加(jia)到(dao)第(di)九(jiu)、第(di)十孔中，再(zai)在(zai)第(di)九(jiu)第(di)十孔分別加(jia)標準品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻後(hou)從第(di)九(jiu)第(di)十孔中各(ge)取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)。（稀(xi)釋(shi)後各(ge)孔加樣(yang)量都(dou)為50μl，濃(nong)度(du)分(fen)別為1200ng/L，800ng/L ，400ng/L，200ng/L，100ng/L）。

2. 加(jia)樣(yang)：分別(bie)設空白孔（空白對(dui)照孔不加樣(yang)品及(ji)酶(mei)標試劑，其(qi)余各(ge)步操作相同）、待測樣(yang)品孔。在(zai)酶(mei)標包(bao)被板上待測樣(yang)品孔中先加樣(yang)品稀(xi)釋(shi)液(ye)40μl，然(ran)後再(zai)加(jia)待測樣(yang)品10μl（樣(yang)品*終(zhong)稀(xi)釋(shi)度為5倍(bei)）。加(jia)樣(yang)將樣(yang)品加(jia)於(yu)酶(mei)標板孔底(di)部(bu)，盡(jin)量(liang)不觸及(ji)孔壁(bi)，輕輕(qing)晃(huang)動混(hun)勻。

3. 溫(wen)育(yu)：用(yong)封(feng)板膜封(feng)板後置(zhi)37℃溫(wen)育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。

4. 配(pei)液(ye)：將30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液(ye)用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)稀(xi)釋(shi)後備用(yong)。

5. 洗(xi)滌(di)：小心揭掉(diao)封(feng)板膜，棄(qi)去(qu)液(ye)體(ti)，甩幹(gan)，每孔加滿洗(xi)滌(di)液(ye)，靜(jing)置(zhi)30秒(miao)後(hou)棄(qi)去(qu)，如(ru)此(ci)重(zhong)復(fu)5次，拍(pai)幹(gan)。

6. 加(jia)酶(mei)：每孔加入(ru)酶(mei)標試劑50μl，空白孔除(chu)外(wai)。

7. 溫(wen)育(yu)：操(cao)作(zuo)同3。

8. 洗(xi)滌(di)：操(cao)作同5。

9. 顯(xian)色：每孔先加入(ru)顯色劑A50μl，再(zai)加(jia)入(ru)顯色劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震(zhen)蕩混(hun)勻，37℃避光(guang)顯(xian)色15分(fen)鐘. 

10. 終(zhong)止(zhi)：每孔加終止(zhi)液(ye)50μl，終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)（此(ci)時(shi)藍(lan)色立(li)轉黃(huang)色）。

11. 測(ce)定(ding)：以(yi)空白空調零(ling)，450nm波(bo)長(chang)依序測(ce)量各(ge)孔的(de)吸(xi)光(guang)度(du)（OD值(zhi)）。 測(ce)定(ding)應(ying)在加(jia)終止液(ye)後15分(fen)鐘(zhong)以(yi)內(nei)進行(xing)。

註(zhu)意(yi)事(shi)項：

1． 試劑盒從(cong)冷(leng)藏(zang)環(huan)境(jing)中取(qu)出應(ying)在室(shi)溫平(ping)衡(heng)15-30分(fen)鐘(zhong)後(hou)方(fang)可使用(yong)，酶(mei)標包(bao)被板開封(feng)後如(ru)未用(yong)完(wan)，板條應(ying)裝入(ru)密封袋中保存(cun)。

2． 濃(nong)洗(xi)滌(di)液(ye)可(ke)能(neng)會(hui)有(you)結(jie)晶(jing)析(xi)出，稀(xi)釋(shi)時可(ke)在水(shui)浴(yu)中加溫助(zhu)溶(rong)，洗(xi)滌(di)時(shi)不影響結(jie)果。

3． 各(ge)步加樣(yang)均(jun)應(ying)使用(yong)加(jia)樣(yang)器(qi)，並經(jing)常(chang)校(xiao)對(dui)其(qi)準確性(xing)，以(yi)避免(mian)試驗(yan)誤差(cha)。壹次加樣(yang)時間*好控制在(zai)5分(fen)鐘(zhong)內(nei)，如標(biao)本數(shu)量(liang)多(duo)，推薦使用(yong)排(pai)槍(qiang)加(jia)樣(yang)。

4． 請每次測定(ding)的(de)同時做(zuo)標準曲線，*好做(zuo)復孔。如標本中待測物(wu)質含量(liang)過高(gao)（樣(yang)本OD值(zhi)大於(yu)標準品孔**孔的(de)OD值(zhi)），請先用(yong)樣(yang)品稀(xi)釋(shi)液(ye)稀(xi)釋(shi)壹定(ding)倍(bei)數(shu)（n倍(bei)）後(hou)再(zai)測(ce)定(ding)，計(ji)算時請*後乘以(yi)總(zong)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數(shu)（×n×5）。

5． 封(feng)板膜只限(xian)壹次性(xing)使(shi)用(yong)，以(yi)避免(mian)交(jiao)叉汙(wu)染。

6． 底(di)物(wu)請避光(guang)保(bao)存(cun)。

7． 嚴(yan)格(ge)按(an)照說明(ming)書的(de)操作(zuo)進行(xing)，試驗(yan)結(jie)果判(pan)定(ding)必(bi)須以(yi)酶(mei)標儀讀(du)數(shu)為準.

8． 所(suo)有(you)樣(yang)品，洗(xi)滌(di)液(ye)和(he)各(ge)種廢棄(qi)物(wu)都應(ying)按傳染物(wu)處(chu)理。

9． 本試劑不同批(pi)號組分(fen)不得混(hun)用(yong)。

10. 如(ru)與(yu)英(ying)文說明(ming)書有(you)異，以(yi)英文(wen)說明(ming)書為準。

計(ji)算：

以(yi)標準物(wu)的(de)濃(nong)度(du)為橫坐標(biao)，OD值(zhi)為縱(zong)坐標(biao)，    

在(zai)坐標(biao)紙上(shang)繪(hui)出標(biao)準曲線，根據樣(yang)品的(de)OD      

值(zhi)由(you)標準曲線查出相(xiang)應(ying)的(de)濃(nong)度(du)；再(zai)乘以(yi)稀(xi)釋(shi)      

倍(bei)數(shu)；或(huo)用(yong)標(biao)準物(wu)的(de)濃(nong)度(du)與(yu)OD值(zhi)計(ji)算出標(biao)      

準曲線的(de)直(zhi)線回歸方程(cheng)式(shi)，將樣(yang)品的(de)OD值(zhi)      

代(dai)入(ru)方程(cheng)式(shi)，計(ji)算出樣(yang)品濃(nong)度(du)，再(zai)乘以(yi)稀(xi)釋(shi)      

倍(bei)數(shu)，即(ji)為樣(yang)品的(de)實際(ji)濃(nong)度(du)。                  

（此(ci)圖僅供(gong)參考(kao)）

試劑盒性(xing)能(neng)：

1.樣(yang)品線性(xing)回歸與(yu)預(yu)期濃(nong)度(du)相(xiang)關系(xi)數(shu)R值(zhi)為0.990以(yi)上。

2.批(pi)內(nei)與(yu)批(pi)見應(ying)分別(bie)小於(yu)9%和(he)11%

保(bao)存(cun)條件(jian)及有(you)效期(qi)：

1.試劑盒保(bao)存(cun)：；2-8℃。

2．有(you)效期(qi)：6個(ge)月(yue)