用(yong)慢(man)病毒篩選(xuan)穩(wen)定(ding)細(xi)胞株(zhu)，以(yi)G418篩選(xuan)方(fang)法為例(li)，篩選(xuan)出(chu)穩(wen)定(ding)整(zheng)合Neomycin抗性(xing)基(ji)因(yin)的細(xi)胞(bao)系。
A、 G418抗(kang)生素(su)*優濃度篩選(xuan)
每(mei)種(zhong)細(xi)胞對(dui)抗(kang)生素(su)的敏(min)感(gan)性不(bu)同，因(yin)此，準備建立(li)穩(wen)定(ding)細(xi)胞系(xi)之(zhi)前(qian)，需(xu)要確定(ding)能夠(gou)在10-14天殺(sha)死(si)細胞(bao)的*佳(jia)濃度。
方法如下：
1、將(jiang)細胞(bao)稀釋到1000個(ge)細(xi)胞/mL，接(jie)種到24孔板，每(mei)孔1ml。
2、接(jie)種後(hou)**天在(zai)100ug/mL~1mg/mL的G418濃(nong)度(du)範(fan)圍內進行(xing)篩選(xuan)。3、每(mei)隔3天跟換1次(ci)培(pei)養(yang)液，保持(chi)G418濃度(du)不(bu)變。
4、選擇出(chu)在10~14天內使細(xi)胞(bao)全部(bu)死(si)亡的*低G418濃(nong)度(du)來進行(xing)下(xia)壹步(bu)的篩選(xuan)試(shi)驗(yan)。由(you)於(yu)每(mei)種細(xi)胞(bao)對(dui)G418的敏(min)感(gan)性不(bu)同，壹般(ban)變動在100ug/ml～1000ug/ml範(fan)圍。
B. 慢病毒感(gan)染細(xi)胞和穩(wen)定(ding)細(xi)胞系(xi)篩選(xuan)
1、在(zai)6孔板培(pei)養(yang)皿內種植(zhi)約5×10^4細胞CO2 孵箱(xiang)培(pei)養(yang)24小時(shi)。
2、準備 3ml 培(pei)養(yang)基(ji)，加(jia)入(ru)Polybrene，終(zhong)濃(nong)度為6-8 μg/ ml。將(jiang)制備好(hao)的適量(liang)病(bing)毒顆粒加(jia)至(zhi)上(shang)述(shu)培(pei)養(yang)基(ji)，輕吹(chui)混(hun)勻。去除舊的培(pei)養(yang)基(ji)，加(jia)入(ru)含(han)病(bing)毒培(pei)養(yang)基(ji)。
3、病毒感(gan)染後(hou) 24小(xiao)時，用(yong)新(xin)鮮(xian)的完(wan)全培(pei)養(yang)基(ji)替(ti)換(huan)含(han)有病(bing)毒的培(pei)養(yang)基(ji)，繼續(xu)培(pei)養(yang)48小時(shi)。
4、換(huan)用(yong)含(han)*優濃度G418 的培(pei)養(yang)基(ji)。根據(ju)細胞(bao)敏(min)感(gan)性不(bu)同，以(yi)後(hou)每(mei)隔3-5天換(huan)用(yong)新(xin)鮮(xian)的含(han)有G418的培(pei)養(yang)基(ji)，以(yi)替(ti)換(huan)含(han)大量死(si)細胞(bao)的培(pei)養(yang)基(ji)。待(dai)抗(kang)性(xing)細胞長(chang)滿以(yi)後(hou)，細(xi)胞轉入(ru)10cm 培(pei)養(yang)皿，同時(shi)，留(liu)壹部(bu)分細胞在原來的60mm 平皿內，待(dai)細(xi)胞(bao)長(chang)滿後(hou)，收獲(huo)細(xi)胞(bao)，在(zai)蛋(dan)白或(huo)mRNA 水平鑒(jian)定(ding)基(ji)因(yin)過表達(da)或(huo)敲低效(xiao)率。
Polybrene 配(pei)制(zhi)：用(yong) 0.9%的NaCl 溶(rong)解(jie)Polybrene 幹(gan)粉(fen)（濃(nong)度(du)為10 mg/ml），高(gao)壓滅菌(jun)，可以(yi)在4 ℃穩(wen)定(ding)存(cun)放1 年(nian)，也(ye)可凍存於(yu)-20℃。幹(gan)粉(fen)可(ke)以(yi)在4 ℃ 穩(wen)定(ding)存(cun)放數(shu)年(nian)。
G418的配(pei)制(zhi)： 取1g G418溶(rong)於(yu)1ml 1M的HEPES液(ye)中(zhong)，加(jia)蒸(zheng)餾水至(zhi)10ml，過濾(lv)消(xiao)毒，4度保存(cun)。
