熒光標記(ji)的(de)siRNA

熒光標記(ji)的(de)siRNA  Fluorescent dye labeled siRNA

熒光標記(ji)的(de)siRNA

我(wo)們(men)可對siRNA末(mo)端(duan)用(yong)多(duo)種熒光標記(ji)物(wu)進(jin)行標記(ji)。標記(ji)後的(de)siRNA可(ke)用(yong)流(liu)式細胞儀(yi)、熒光顯微鏡、激(ji)光共聚(ju)焦(jiao)顯微鏡等(deng)觀(guan)察到，確定轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率(lv)，優化轉(zhuan)染(ran)條(tiao)件(jian);標記(ji)的(de)siRNA還可用(yong)作(zuo)siRNA胞(bao)內定(ding)位(wei)及(ji)雙(shuang)標記(ji)實(shi)驗（配(pei)合標記(ji)抗(kang)體(ti)）來(lai)追(zhui)蹤(zong)轉染(ran)過(guo)程中導入(ru)了(le)siRNA的細(xi)胞，將(jiang)轉(zhuan)染(ran)與靶(ba)蛋白表(biao)達的(de)下(xia)調(tiao)結(jie)合起來。

我(wo)們(men)可對siRNA末(mo)端(duan)用(yong)多(duo)種熒光標記(ji)物(wu)進(jin)行標記(ji)。標記(ji)後的(de)siRNA可(ke)用(yong)流(liu)式細胞儀(yi)、熒光顯微鏡、激(ji)光共聚(ju)焦(jiao)顯微鏡等(deng)觀(guan)察到，確定轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率(lv)，優化轉(zhuan)染(ran)條(tiao)件(jian);標記(ji)的(de)siRNA還可用(yong)作(zuo)siRNA胞(bao)內定(ding)位(wei)及(ji)雙(shuang)標記(ji)實(shi)驗（配(pei)合標記(ji)抗(kang)體(ti)）來(lai)追(zhui)蹤(zong)轉染(ran)過(guo)程中導入(ru)了(le)siRNA的細(xi)胞，將(jiang)轉(zhuan)染(ran)與靶(ba)蛋白表(biao)達的(de)下(xia)調(tiao)結(jie)合起來。反義鏈5'端(duan)標記(ji)會影響(xiang)其(qi)基因沈默(mo)活性，所(suo)以不推(tui)薦在這壹位(wei)點進(jin)行標記(ji)。在其(qi)他(ta)三個末端修飾(shi)對沈默(mo)活性幾乎沒有影響(xiang)。我們(men)推(tui)薦在正(zheng)義鏈的(de)5'端修(xiu)飾(shi)，目(mu)前公(gong)認這是*佳(jia)的(de)化學標記(ji)位(wei)點。

本公司(si)提(ti)供(gong)的siRNA相(xiang)關產品直接作(zuo)用(yong)於(yu)靶(ba)基因mRNA，因此我們(men)建(jian)議(yi)您在收(shou)到我(wo)們(men)的相(xiang)關產品後先(xian)進(jin)行實(shi)時定量(liang)PCR檢測，以確定靶(ba)基因mRNA表(biao)達水平的(de)變化，進(jin)而(er)直接確(que)認我們(men)合成(cheng)或(huo)構(gou)建(jian)的(de)siRNA產品是(shi)否(fou)有效(xiao)。

使用(yong)方(fang)法(fa)

壹、熒光標記(ji)的(de)siRNA

轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率(lv)的高(gao)低(di)可(ke)以通(tong)過(guo)熒光標記(ji)的(de)siRNA（FAM-siRNA）實(shi)現。

FAM-siRNA 轉染(ran)細(xi)胞(bao)後，可(ke)以用(yong)熒光顯微鏡、激(ji)光共聚(ju)焦(jiao)顯微鏡、流(liu)式細胞儀(yi)等檢(jian)測，確定(ding)是(shi)否(fou)有效(xiao)轉染(ran)和(he)優化轉(zhuan)染(ran)條(tiao)件(jian)。FAM-siRNA 還可用(yong)作(zuo)siRNA 胞(bao)內定(ding)位(wei)及(ji)雙(shuang)標記(ji)實(shi)驗（配(pei)合標記(ji)抗(kang)體(ti)）來(lai)追(zhui)蹤(zong)轉染(ran)過(guo)程中導入(ru)了(le)siRNA 的細(xi)胞，將(jiang)轉(zhuan)染(ran)與靶(ba)蛋白表(biao)達的(de)下(xia)調(tiao)結(jie)合起來。

二、使用(yong)熒光標記(ji)的(de)siRNA（FAM-siRNA）檢(jian)測轉染(ran)效(xiao)率(lv)

1 FAM-siRNA的溶(rong)解及(ji)保(bao)存

1.1 由(you)於(yu)OligoRNA很(hen)輕的(de)幹(gan)膜(mo)狀附(fu)在管壁上，打開時極易散(san)失(shi)，所(suo)以打開離心(xin)管前(qian)先(xian)離(li)心(xin)，然(ran)後再(zai)慢(man)慢打開管蓋(gai)，溶(rong)解時加(jia)適(shi)量(liang)DEPC水後蓋(gai)上管蓋，振(zhen)蕩(dang)溶(rong)解。

1.2 需(xu)要濃度(du)20uM的(de)樣品(pin)，如(ru)何計(ji)算(suan)重(zhong)懸(xuan)siRNA緩(huan)沖液(ye)的量(liang)？妳購(gou)買了(le)1OD的siRNA，想(xiang)溶(rong)解為20uM 的樣(yang)品(pin)，應該(gai)使用(yong)150ul附(fu)送(song)的(de)DEPC水去(qu)重懸(xuan)1OD的(de)siRNA,溶(rong)解後為(wei)20uM的(de)樣品。

1.3 貯(zhu)存和(he)穩定性：-20℃，避(bi)光保(bao)存，凍(dong)幹(gan)粉(fen)或(huo)液(ye)體(ti)。液(ye)體(ti)（貯(zhu)存濃(nong)度為(wei)20μM）避(bi)免反復凍(dong)融，**********保(bao)證在上述條件(jian)下(xia)siRNA oligo的(de)穩定性可(ke)達(da)到6個月。

2 轉(zhuan)染(ran)

2.1 使用(yong)lipofectamin2000 轉(zhuan)染(ran)的(de)步(bu)驟(zhou)（以貼(tie)壁細胞為例(li)，僅供(gong)參考(kao)）

(1)以24孔(kong)培養(yang)板操作(zuo)為(wei)例(li)（其(qi)他(ta)孔(kong)板各(ge)種(zhong)的(de)試劑(ji)用(yong)量(liang)，請參照(zhao)“Lipofectamine2000 manual”），轉(zhuan)染(ran)前(qian)**，將(jiang)0.5~2X105個細胞接種(zhong)於(yu)培(pei)養(yang)板中，每孔(kong)中加(jia)入(ru)約500ul無(wu)抗(kang)生素(su)的培(pei)養(yang)基，使轉染(ran)時的細胞密度(du)能(neng)夠(gou)達(da)到30～50％；

(2) 取1μl/孔(kong) Lipofectamine2000（使用(yong)前(qian)輕輕搖(yao)勻），用(yong)50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋(shi)。輕輕混和(he)後在室溫孵育(yu)5 min；

(3) 取2ul FAM-siRNA，用(yong)50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀釋(shi)，輕輕混和(he)均(jun)勻;

(4) 稀釋(shi)的Lipofectamine2000（2）經過(guo)5min 的孵育(yu)後，與稀釋(shi)FAM-siRNA（3）輕輕混和(he)，室溫靜(jing)置(zhi)20min，以形成(cheng)FAM-siRNA-轉(zhuan)染(ran)試劑(ji)混和(he)物(wu)，如(ru)果溶(rong)液(ye)出(chu)現渾(hun)濁(zhuo)，屬(shu)於(yu)正(zheng)常(chang)現象，不會影響(xiang)轉染(ran)效(xiao)果(guo)。

註意(yi)：稀釋(shi)的Lipofectamine2000（2）盡(jin)量(liang)在25min 之(zhi)內，和(he)稀釋(shi)的FAM-siRNA 混和(he)，如(ru)果放(fang)置(zhi)時間過(guo)長，可(ke)能(neng)導致(zhi)轉(zhuan)染(ran)試劑(ji)活(huo)性的(de)降(jiang)低(di);

(5) 將(jiang)FAM-siRNA-轉(zhuan)染(ran)試劑(ji)混和(he)液(ye)（4）加(jia)入(ru)含有(you)細胞(bao)及(ji)培(pei)養(yang)液(ye)（約含(han)400ul）的(de)孔(kong)中，輕輕搖(yao)晃(huang)孔(kong)板，使混和(he)；

(6) 在37 ℃的CO2 培(pei)養(yang)箱中培養(yang)，4-6 小時後可(ke)將(jiang)培(pei)養(yang)基換(huan)為含(han)血清的完全(quan)培養(yang)基(該(gai)步驟(zhou)可(ke)以省略);

(7)轉染(ran)6小時後即(ji)可(ke)檢測轉染(ran)效(xiao)率(lv)：流(liu)式細胞儀(yi)、熒光顯微鏡、激(ji)光共聚(ju)焦(jiao)顯微鏡等(deng)（見(jian)後面(mian)）。

2.2 轉(zhuan)染(ran)操(cao)作(zuo)註意(yi)事(shi)項(xiang)：

（1）FAM-siRNA 的轉染(ran)過(guo)程和(he)普通(tong)siRNA 是壹樣的(de)，註(zhu)意整個實(shi)驗過(guo)程要盡(jin)量(liang)避(bi)光，建(jian)議(yi)轉染(ran)時室內和(he)超凈臺內不(bu)要開燈；

（2）保持FAM-siRNA 管(guan)外(wai)有(you)錫(xi)紙(zhi)包(bao)裹，在靜(jing)置(zhi)lipo-siRNA 過(guo)程中盡(jin)量(liang)避(bi)光，

（3）轉(zhuan)染(ran)操(cao)作(zuo)盡(jin)量(liang)快(kuai)，操作(zuo)時間盡(jin)量(liang)短，操(cao)作完畢請盡(jin)快(kuai)將(jiang)培(pei)養(yang)板放(fang)到(dao)培(pei)養(yang)箱。

（4）壹般來(lai)說(shuo)，使用(yong)Lipofectamine 2000 作(zuo)為(wei)轉(zhuan)染(ran)試劑(ji)，4～6 小時就可(ke)以保證siRNA 轉(zhuan)染(ran)進(jin)入(ru)細胞(bao)。因此轉染(ran)效(xiao)率(lv)的檢(jian)測可以在轉染(ran)後6小時（轉染(ran)過(guo)程完成(cheng)）進(jin)行。

3、觀察與檢(jian)測

3.1 檢測方(fang)法(fa)：熒光顯微鏡、激(ji)光共聚(ju)焦(jiao)顯微鏡、流(liu)式細胞儀(yi)

3.2 熒光顯微鏡觀(guan)察註意事項(xiang)（流(liu)式細胞儀(yi)或(huo)激(ji)光共聚(ju)焦(jiao)顯微鏡檢(jian)測請參照(zhao)儀(yi)器說(shuo)明書(shu)）：

（1）FAM 是壹種綠(lv)色(se)熒光基(ji)團(tuan)，由藍光激(ji)發(fa)，激發(fa)波長480nm，發射(she)波長520nm。

（2）使用(yong)Lipofectamine 2000 轉(zhuan)染(ran)後6 小時就可(ke)以檢測，檢測前細(xi)胞(bao)處理(li)等操(cao)作(zuo)都必須避(bi)光！對於(yu)檢(jian)測的時間要求(qiu)相(xiang)對不(bu)是(shi)特別嚴格(ge)，成(cheng)功(gong)轉染(ran)的(de)細(xi)胞如(ru)果沒有受(shou)到強(qiang)光刺(ci)激的(de)話，熒光壹般不(bu)會消失(shi)，我(wo)們(men)建(jian)議(yi)盡(jin)量(liang)在轉染(ran)後24 小時內完成(cheng)檢(jian)測。

（3）確保(bao)熟(shu)悉(xi)熒光顯微鏡操(cao)作(zuo)。建(jian)議(yi)檢測時，可以先使光路先(xian)對準(zhun)沒有轉染(ran)FAM -siRNA的(de)孔(kong)，調好(hao)焦(jiao)距(ju)打開激發(fa)光，壹切準(zhun)備就緒(xu)後再(zai)進(jin)行觀察（壹般情況下(xia)可(ke)以馬(ma)上看到熒光）。

（4）觀(guan)察時間不宜過(guo)長，盡(jin)量(liang)避(bi)免熒光被(bei)猝(cu)滅(mie)，光路對準(zhun)轉(zhuan)染(ran)孔(kong)，馬(ma)上觀察和拍照(zhao)。拍完熒光照(zhao)片(pian)後，*好(hao)在同壹視野中拍下(xia)明場的細(xi)胞照(zhao)片(pian)。

（5）只有成(cheng)功(gong)轉染(ran)的(de)細(xi)胞才能(neng)看(kan)到FAM 綠(lv)色(se)熒光，與綠(lv)色(se)熒光蛋(dan)白(bai)GFP 的熒光不(bu)太壹樣，FAM 的(de)熒光比(bi)較弱，散在分(fen)布在細胞(bao)質中。

（6）由於(yu)熒光容(rong)易猝(cu)滅(mie)，應用(yong)計(ji)數(shu)的方(fang)法(fa)計算轉染(ran)效(xiao)率(lv)效果(guo)不(bu)好(hao)，*好用(yong)流(liu)式細胞儀(yi)檢測。

（7）如(ru)果您(nin)對我(wo)們(men)FAM-siRNA 質量(liang)有任(ren)何質疑的話，您可(ke)以從(cong)中吸取少(shao)量(liang)（2～5μl）FAM-siRNA，加(jia)在載(zai)玻片(pian)上，蓋上蓋玻片(pian)，直接於(yu)熒光顯微鏡下(xia)觀(guan)察。註意保證FAM-siRNA 的(de)保(bao)存和(he)使用(yong)方(fang)法(fa)無(wu)誤，另(ling)外(wai)，所(suo)有(you)操(cao)作(zuo)都必須在避(bi)光條(tiao)件(jian)下(xia)進(jin)行。

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